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PCR技術(shù)三十周年紀 上世紀八十年代Cetus Corporation公司的化學(xué)家Kary Mullis發(fā)明了PCR，如今DNA擴增儼然已經(jīng)成為了生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。今年正值PCR技術(shù)誕生三十周年，讓我們看看如今的PCR是個什么模樣。生物通 www.ebiotrade.com 
三十年來，人們?yōu)榱私鉀Q研究中出現(xiàn)的新問題新需求，不斷對這一經(jīng)典技術(shù)進行改進，催生出了越來越多的新研究工具。如今PCR技術(shù)早已走出實驗室，在遺傳學(xué)鑒定和疾病診斷中發(fā)揮著巨大的作用，在越來越廣闊的領(lǐng)域里煥發(fā)著新的活力。
高保真酶生物通 www.ebiotrade.com 
PCR技術(shù)長盛不衰的秘訣之一就是，以模板為基礎(chǔ)合成新鏈的DNA聚合酶一直在不斷地發(fā)展。“自PCR技術(shù)誕生以來，PCR的進步很大程度上依賴于酶學(xué)的發(fā)展，”Thermo Scientific的產(chǎn)品經(jīng)理Edita Smergeliene說。現(xiàn)在我們已經(jīng)難以想象，沒有自動化PCR儀也沒有熱穩(wěn)定聚合酶的原始PCR實驗。當年的研究人員得親手控制樣品溫度，將新鮮的DNA聚合酶添加到每個循環(huán)中。從源自E. coli的原始DNA聚合酶，到更耐熱但易出錯的Taq酶（源于Thermus aquaticus），再到不易出錯的校讀型DNA聚合酶，人們在不斷改造著PCR酶以滿足日益增長的特殊需求。
如今“高保真”DNA聚合酶設(shè)計得更為精益求精。例如Thermo Scientific公司的Phusion高保真DNA聚合酶，將具有校讀功能的古細菌酶與耐熱的DNA結(jié)合蛋白融合在一起。“這種結(jié)合蛋白能增強聚合酶與雙鏈DNA的親和力，”Smergeliene說。“Phusion的強勁性能及其高超的持續(xù)合成能力，使其特別耐受PCR抑制劑，可以在標準聚合酶無能為力時大顯身手。”EMD Millipore公司的KOD高保真DNA聚合酶特別適用于PCR的新應(yīng)用領(lǐng)域，例如二代測序（NGS）和生物學(xué)合成等。“我們的PureGenome? 二代測序試劑盒就采用了KOD 高保真DNA聚合酶，能夠有效降低NGS文庫制備中的偏好。對于以PCR為基礎(chǔ)的高通量測序來說，偏好性是一個很普遍的問題，”EMD Millipore公司的基因組產(chǎn)品經(jīng)理Ayaz Majid說。生物通 www.ebiotrade.com 
NEB公司去年剛推出的新產(chǎn)品Q5超保真DNA聚合酶，融合了Sso7d DNA結(jié)合域。該產(chǎn)品將延伸時間縮短到了10秒/ kb，而且其保真度比Taq酶高100倍。此外，Bio-Rad公司的高保真PCR試劑也采用了DNA結(jié)合蛋白Sso7d。他們將其與有校讀活性的聚合酶融合，這種iProof DNA聚合酶能夠?qū)щy的長目標實現(xiàn)快速擴增，還能耐受一些樣本中的PCR抑制劑。
在如今多樣化的PCR應(yīng)用中，早已無法一“酶”走遍天下。Kapa Biosystems公司開始采用高通量的定向方法，來為特殊PCR應(yīng)用設(shè)計專門的DNA聚合酶，例如NGS。“我們在大量特殊蛋白中進行篩選，尋找能大大增強酶功能的突變體，”Kapa Biosystems的技術(shù)指導(dǎo)John Foskett說，他專門為NGS文庫擴增設(shè)計了高保真的KAPA HiFi DNA聚合酶。“這一產(chǎn)品幾經(jīng)優(yōu)化，能夠有效降低PCR帶來的偏好并且提高產(chǎn)量，從而得到更為一致的測序覆蓋度，增加文庫的復(fù)雜程度。”生物通 www.ebiotrade.com 
百里挑一
在PCR誕生初期，可供選擇的聚合酶非常有限。不過時至今日，在進行PCR實驗之前，五花八門的酶就足以閃花我們的雙眼。沒的選讓人無奈，選擇太多又令人頭疼，這該如何是好？生物通 www.ebiotrade.com 
大多數(shù)專家在選擇PCR試劑時，主要考慮的是自己的實驗應(yīng)用和樣品的內(nèi)在性質(zhì)。如果關(guān)鍵在于擴增產(chǎn)物的測序精確性，那么就應(yīng)選擇高保真酶。同樣，也有相應(yīng)產(chǎn)品適用于擴增特別長的DNA目標。“DNA重復(fù)序列會給PCR擴增帶來難度，例如TA重復(fù)。復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)也會給擴增帶來麻煩，例如復(fù)含GC的重復(fù)序列，”Majid說。“這時你就需要性能強勁的酶和適宜的緩沖條件，來克服挑戰(zhàn)性的模板。”在這種情況下，NEB的Q5超保真DNA聚合酶和EMD-Millipore的KOD Xtreme? DNA聚合酶都是不錯的選擇。
如果需要特別防范意外突變，那么最好使用帶有校讀能力的酶。若是想要得到高產(chǎn)量的DNA用于芯片檢測或NGS，就需要持續(xù)合成能力強延伸速度快的酶，例如EMD Millipore家的高保真KOD DNA聚合酶，或者Thermo家的Phusion高保真DNA聚合酶。此外，熱啟動的DNA聚合酶能夠顯著提升PCR反應(yīng)的特異性，并且適用于自動化系統(tǒng)。生物通 www.ebiotrade.com 
常規(guī)DNA聚合酶和高保真DNA聚合酶該如何取舍，往往令人感到困惑。一般來說，對于那些只需快速核對序列的常規(guī)PCR，或者對某個克隆步驟的鑒定，是不需要高保真酶的，缺乏3-5'外切酶活性的常規(guī)酶就足夠了。不過，特異性和敏感度較高的酶更有利于對低量DNA進行擴增。
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市面上DNA聚合酶種類繁多，看得久了難免無所適從。Kapa Biosystem公司的John Foskett一針見血地指出，我們實際上面臨的選擇只有兩種。“盡管市面上的PCR試劑琳瑯滿目，不過從根本上來說就是兩類：tag或校讀型酶，tag及校讀型酶，”他說。“PCR試劑間任何性能上的差異，主要是來自于緩沖液或酶濃度的改變，在蛋白質(zhì)水平上并沒有根本性的差異。”

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數(shù)字PCR是本領(lǐng)域最激動人心的創(chuàng)新之一，這一技術(shù)能夠?qū)悠分械腄NA分子數(shù)進行絕對定量。目前可以進行數(shù)字PCR的平臺包括：Life Technologies公司的QuantStudio? 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)，Bio-Rad公司的QX100微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）系統(tǒng)，F(xiàn)luidigm公司的qdPCR 37K? IFC系統(tǒng)，以及RainDance Technologies的RainDrop數(shù)字PCR系統(tǒng)。絕大多數(shù)數(shù)字PCR系統(tǒng)的工作原理是，將DNA樣品分成大量微小液滴，每個液滴中只含有不超過一個DNA分子，然后再進行計數(shù)。據(jù)Bio-Rad公司的ddPCR商品化市場經(jīng)理James Lee介紹，“數(shù)字PCR大大提高了靈敏度和精確性，因此ddPCR特別適用于絕對定量、檢測拷貝數(shù)變異和罕見事件。”Life Technologies的基因分析高級市場開發(fā)經(jīng)理Angelique Habis稱，數(shù)字PCR具有廣闊的應(yīng)用前景，例如檢測癌癥樣本中的罕見靶標，檢測病原體，病毒載量的絕對定量，NGS文庫的質(zhì)控等等。
直接PCR是PCR領(lǐng)域的又一大創(chuàng)新，該技術(shù)無需通常的DNA純化步驟，可以直接在收集到的樣品上進行PCR（如組織和血液）。這要歸功于化學(xué)領(lǐng)域的突破，“為了能夠在這樣的條件下進行擴增，聚合酶必須對樣品中的PCR抑制劑有相當強的抵抗力，這樣的抑制劑包括血液成分等，”Smergeliene說。“持續(xù)合成能力強的DNA聚合酶（如Phusion或Phire酶）就具有這樣的額外特性，這也是Thermo Scientific直接PCR試劑盒的核心。”此外，EMD Millipore的KOD Xtreme聚合酶也是為檢測原始樣品而設(shè)計的。生物通 www.ebiotrade.com 
PCR儀之變：隨著技術(shù)的進步，人們也在不斷改進PCR儀的性能。例如，減少PCR所需的樣品體積，以便節(jié)省寶貴的罕見材料，降低試劑成本，并且減少廢棄物對環(huán)境的影響。此外，PCR儀的設(shè)計重點還在于提高反應(yīng)效率，同時節(jié)省實驗室空間。舉例來說，Thermo Scientific公司Piko PCR儀的反應(yīng)體積可以低至5 μL，該公司還提供超薄的微孔板和小管以便達到更好的熱傳遞效果，降低能源的消耗。“該儀器小巧輕便而且噪音低，能幫助用戶大大節(jié)省時間、試劑、空間和能源，”Thermo Fisher Scientific的產(chǎn)品經(jīng)理Kari Kataja說。有的PCR儀廠家繼續(xù)在提高PCR的精確度和可重復(fù)性上下功夫，例如Eppendorf。“我們的熱模塊溫度精確性高，均一性好，而且能減少樣品的蒸發(fā)，”Eppendorf產(chǎn)品經(jīng)理Kay Koerner說。
三十年前的人們一定無法想象PCR技術(shù)今天的模樣，而三十年后的今天PCR技術(shù)仍在不斷的發(fā)展。“三十年前，沒人料到DNA復(fù)制這樣一個簡單的概念，會對生物學(xué)和人類健康帶來如此大的轉(zhuǎn)變，”Foskett說。“現(xiàn)在，高靈敏度低偏好性的全基因組擴增方法，使單細胞基因組分析得以實現(xiàn)，而這將大大推動胚胎植入前遺傳學(xué)篩查等領(lǐng)域的發(fā)展。”人們常說“三十而立”，PCR也在其三十歲生日之際進入了全盛期，開始向人們展示它的真正力量。